Практические методики исследования растений
ЦИТОЛОГИЯ (КАРИОЛОГИЯ)
Процесс приготовления давленых препаратов для кариологического анализа при рутинной окраске состоит из четырех стадий: предварительная обработка растительного материала, фиксация, окраска и собственно приготовление препарата.
Предварительная обработка материала. Для накопления делящихся клеток на стадии метафазы и укорочения хромосом проводится предфиксационная обработка материала. Для этого используют растворы колхицина, 8–оксихинолина, α–бромнафталина или пара–дихлорбензола. Можно использовать и комбинированные обработки. Концентрации растворов и продолжительность обработки желательно подобрать экспериментально для своего объекта. Ориентировочные концентрации следующие: колхицин – 0,01–0,2%; 8-оксихинолин – насыщенный или 0,002М раствор (0,058 г вещества растворяют в 200 мл теплой дистиллированной воды); α-бромнафталина или пара-дихлорбензола – используют насыщенные растворы. Продолжительность обработки (ориентировочно): при использовании колхицина – 2 часа, при использовании остальных веществ 3–4 часа. Предварительная обработка проводится при комнатной температуре, но иногда рекомендуют пониженные температуры (в холодильнике, при 3–4°С). Наиболее важный момент этой стадии – определение времени начала предварительной обработки для получения наиболее интенсивного деления меристематических клеток. В условиях Новосибирска это 10–12 часов утра и 16–18 часов вечера (зимнее время) для большинства видов. Но у части видов (высокогорных, эфемеров и некоторых других) время смещается ближе к полудню. Это легко объяснимо тем, что в природе именно в это время происходит наибольшее прогревание почвы и начинается рост растений. При работе с отдельными видами или родами растений мы рекомендуем провести суточный цитологический анализ растений с целью выявления наиболее оптимального времени начала обработки для получения максимального числа делящихся клеток. Эффект от просмотра препарата с 3–4 делящимися клетками разительно отличается от препарата, где иногда более 50% клеток в поле зрения микроскопа находятся на стадии деления!
Известны также способы синхронизации митозов в меристеме растений воздействием химических веществ или низкими температурами. При последнем способе проросшие семена помещают в холодильник на 3–5 сут при температуре –1...–2 °С. После обработки холодом все последующие операции проводятся при комнатной температуре.
Второй момент, который также подбирается экспериментальным путем – величина корешка. У некоторых видов корешки в семени находятся в сложенном состоянии и в первые часы или даже сутки происходит не рост, а оводнение и механическое растяжение тканей (например, у растений семейства Fabaceae и др.). Поэтому иногда корешки длиной 5–7 мм не имеют делящихся клеток. И, наконец, одна из типичных ошибок при предварительной обработке – мелкие или опушенные семена с корешками могут плавать на поверхности раствора, снижая тем самым действие химических агентов! Поэтому при помещении таких семян их нужно "утопить".
Фиксация материала. Мы рекомендуем использовать Фиксатор Кларка или его еще называют "уксуснокислый спирт" или упрощенный Карнуа. Его состав: этиловый спирт 96°– 3 части, ледяная уксусная кислота – 1 часть. Здесь следует соблюдать лишь одно правило – фиксатора необходимо примерно в 10 раз больше фиксируемого материала. Длительность фиксации от нескольких часов до одних суток. Затем материал дважды промывается в 70% спирте и в таком же спирте помещается на хранение, желательно при пониженной температуре (в холодильнике). Фиксированный материал в 70% спирте может храниться несколько месяцев. Несколько дней материал можно хранить и в фиксаторе.
Приготовление красителя и окраска. 1 г. гематоксилина растворяется в 50 мл дистиллированной воды кипячением на водяной бане или на слабом огне, раствор выдерживается на свету в посуде, удобной для свободного доступа воздуха в течение трех суток, затем к нему добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты. Для более интенсивного окрашивания в рабочий раствор добавляется несколько капель уксуснокислого железа или на несколько секунд в него опускается железный предмет. Приготовленный таким образом раствор красителя годен для употребления неограниченно долгое время. Для протравливания растительного материала приготовляется 4% раствор железоаммонийных квасцов.
Фиксированный препарат протравливается 2–20 минут в растворе квасцов, излишек квасцов удаляется ополаскиванием в дистиллированной воде или прикосновением фильтровальной бумаги, затем объект помещается в раствор красителя и нагревается 2–3 раза до кипения. Для этого мы рекомендуем использовать фарфоровые тигли объемом 5 мл. У нового тигля необходимо поцарапать дно для образования точек кипения, в противном случае будет происходить выброс красителя. На 2–3 корешка используется 1–1,5 мл раствора. Наша настоятельная рекомендация – не использовать один и тот же краситель дважды! Экономии красителя в этом случае не будет, о вот материал будет, как правило, испорчен!
Приготовление давленых препаратов. При этом методе окраски одновременно происходит и мацерация растительного материала, что облегчает приготовление препаратов. Под бинокулярной лупой или без нее препаровальной иглой отрезается кончик корешка и помещается на предметное стекло в каплю одного из следующих растворов: глицерина, 45% уксусной кислоты (45 мл ледяной уксусной кислоты + 55 млдистиллированной воды). Обратите внимание: кислоту наливают в воду!) или насыщенного раствора хлоралгидрата (5 г хлоралгидрата растворяется в 2 мл воды). Сверху препарат накрывается покровным стеклом и нагревается на спиртовке 1–2 секунды 2–3 раза. Главное здесь не допустить закипания раствора и его выброс с препарата. Затем концом спички, одновременно придерживая покровное стекло, круговым движением или осторожным постукиванием по покровному стеклу материал равномерно рассредоточивается в один слой клеток и препарат готов для исследования под микроскопом. После предварительного просмотра, последнюю операцию можно повторить, добиваясь более равномерного расположения клеток и лучшего расположения хромосом в них. При использовании хлоралгидрата (предпочтительнее) или глицерина препараты не высыхают несколько дней. При использовании 45% уксусной кислоты необходимо края покровного стекла заклеить парафином, иначе через 2–3 часа препарат высохнет и будет непригоден для анализа.
Препараты просматривают под микроскопом с зеленым фильтром сначала при малом увеличении, затем под большим с использованием масляной иммерсии. Клетки с хорошим разбросом хромосом, без наложений и находящиеся в одной плоскости зарисовывают или фотографируют (рис. 20).
Рис. 20. Метафазные пластинки:
а – Taraxacum officinale (2n=24); б – Viola irinae (2n=48). Фото А.А. Красникова.
При использовании зеленого фильтра хромосомы выглядят черными. Это очень удобно при визуальном наблюдении, но вот при фотографировании на цветную камеру необходимо для получения качественных и контрастных фотографий подобрать другой фильтр или фотографировать без него, используя настройки камеры или программы.
Гематоксилин сам не является красителем, но он легко окисляется в гематеин и соединяясь с протравой, образует лаки, которые и окрашивают. Для протравливания материала используют соли алюминия, железа, меди и др. Такое "механическое" окрашивание маскирует тонкую структуру хромосом. Так, например, у мелких хромосом часто затруднительно найти границы центромеры, у крупных хромосом не всегда заметны вторичные перетяжки и т.д. Поэтому окрашивание ацетогематоксилином рекомендуется для определения чисел хромосом. Для изучения морфологии хромосом мы советуем проводить окраску ацетоорсеином. Он хорошо окрашивает ядра и хромосомы и гораздо хуже другие структуры, поэтому препараты получаются чистыми, в отличие от окраски ацетогематоксилином.
Приготовление красителя. К 2 г орсеина добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и оставляют на сутки. Затем нагревают (под тягой!) до кипения. К остывшему раствору приливают 50 мл дистиллированной воды и снова нагревают до кипения. Через сутки краситель фильтруют и добавляют к нему 1Н соляную кислоту в соотношении 9 : 1. Соляную кислоту 1Н получают следующим образом: 8–9 мл концентрированной кислоты (точная концентрация здесь не важна) вливают через воронку в мерную колбу объемом 200 мл, предварительно наполненную на 1/4 дистиллированной водой, перемешивают и затем объем раствора доводят водой до 100 мл. Можно использовать стандарт-титры HCl. Перед употреблением краситель рекомендуется фильтровать.
Фиксированные корешки или молодые листочки помещают в раствор красителя на сутки или более, в зависимости от величины корешка и объекта.
Краситель в своем составе имеет соляную кислоту и поэтому одновременно с окрашиванием происходит и мацерация тканей. В некоторых случаях для мацерации применяют пектиназу: корешки из фиксатора или спирта промывают дистиллированной водой и обрабатывают при комнатной температуре в течение 30–60 минут в растворе пектиназы (1–3 мг на 1 мл воды). Далее корешки переносят в краситель.
После окраски все операции такие же , как и при окраске гематоксилином. Единственное отличие (и это важно!) – давленые препараты необходимо готовить в капле ацетоорсеина или в 45% уксусной кислоте, т.к. хлоралгидрат обесцвечивает этот краситель.
При описании кариотипов мы рекомендуем пользоваться методиками "Ботанического журнала" (Агапова, Гриф, 1982; Гриф, Агапова, 1986).
О других методах окраски хромосом (фуксином, кармином, дифференциальной окраске и др.) и методиках приготовления временных и постоянных препаратов можно ознакомиться в приводимом ниже списке литературы. Там же приводятся и список основных сводок по хромосомным числам растений.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРТИЛЬНОСТИ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН
Для определения фертильности пыльцевых зерен используют обычно два метода: ацетокарминовый и йодный.
Ацетокарминовый метод. Соцветия или цветки со зрелой пыльцой фиксируют в фиксаторе Кларка (этиловый спирт : ледяная уксусная кислота / 3:1). Продолжительность фиксации колеблется от 30 мин до нескольких часов. Материал дважды промывают 80% этиловым спиртом и хранят в нем же в холодильнике. Фертильность пыльцы можно определять ацетокарминовым методом без предварительной фиксации, т.е. используя свежий материал. Это особенно важно при экспресс-анализе.
Для анализа пыльник выкладывают на предметное стекло и раздавливают пинцетом в капле ацетокармина. Желательно использовать железный пинцет, так как ионы железа способствуют более интенсивному окрашиванию. С хромированных пинцетов предварительно следует убрать напильником или наждачной бумагой защитный слой хрома. Убрав лишние ткани, препарат накрывают покровным стеклом и осторожно подогревают на спиртовке. Для повышения контрастности и чистоты препарата, его можно осветлить: придерживая покровное стекло, с одной стороны по каплям добавляют 45% раствор уксусной кислоты, а с другой стороны фильтровальной бумагой отсасывают излишек жидкости. В этом процессе главное проследить за тем, чтобы слой жидкости под покровным стеклом был не слишком большим и не выходил за края, иначе можно вымыть все зерна. В результате получаем окрашенные пыльцевые зерна на светлом фоне. Временные препараты могут храниться несколько часов. Для более длительного хранения следует по краю покровного стекла нанести слой лака (для ногтей) или слой парафина: нагревают скальпель на спиртовке (горелке), опускают в парафин и быстро проводят по краю покровного стекла, последовательно с четырех сторон. Такая заливка позволяет сохранить препарат несколько суток.
У фертильных пыльцевых зерен зернистая цитоплазма и спермии окрашены в густой карминово-красный цвет. Стерильные пыльцевые зерна почти не окрашиваются или их окраска неравномерна (рис. 21а).
Подсчитывают процент фертильных пыльцевых зёрен от общего числа, наблюдаемых 3-5 полях зрения микроскопа или на фотографиях.
Приготовление ацетокармина. 1–2 г кармина растворяют в 100 мл 45%- ной уксусной кислоте (45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды). Растворение ведется в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 30–60 минут. После остывания раствор фильтруют и помещают в посуду с притертой пробкой.
Йодный метод. В его основе лежит определение крахмала при помощи йодной реакции. Фертильные и стерильные пыльцевые зерна отличаются по содержанию крахмала. Обычно фертильное пыльцевое зерно полностью заполнено крахмалом, а стерильное не имеет его совсем или содержит следы.
Препарат готовят так же, как и при предыдущем методе, используя вместо ацетокармина йодный раствор.
Под микроскопом можно легко отличить фертильные пыльцевые зерна по интенсивному окрашиванию (рис. 21б). Стерильные пыльцевые зерна остаются неокрашенными Неокрашенными оказываются и оболочки пыльцевых зерен.
Приготовление йодного раствора. 2 г йодида калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды при нагревании. Затем в раствор добавляют 1 г кристаллического йода, доводят до 300 мл и хранят в склянке из оранжевого стекла. Иногда хорошие результаты дает применение аптечного (5%) препарата йода, разбавленного в 10 раз (0,5%) или аптечного препарата – Раствора Люголя.
Рис. 21. Пыльцевые зерна: а – стерильные и фертильные Rosa sp. Окраска ацетокармином. Фото А.А. Красникова; б – зерно Alstroemeria сорта Регина. Окраска йодом. Фото Черемисиной А.В.
ИЗУЧЕНИЕ МЕЙОЗА
Методика изучения мейоза не отличается от вышеописанной ацетокарминовой методики определения фертильности пыльцы, но имеет ряд особенностей. Мейоз изучают в материнских клетках пыльцы. Поэтому фиксировать бутоны необходимо до образования зрелых пыльцевых зерен. Желательно фиксировать бутоны разных размеров, крупные бутоны разрезают на части для ускоренного проникновения фиксатора. Для каждого объекта экспериментально подбираются размеры бутонов и время фиксации (утренние часы или обеденное время). Визуально, пыльники должны быть прозрачные или слегка зеленовато-желтоватые, плотные, упругие.
Перед изучением, флакон с красителем и пыльниками можно нагреть на водяной бане до кипения и остудить. Но эта операция нужна только для крупных пыльников, мелкие хорошо прокрашиваются в капле ацетокармина.
Далее все операции проводятся согласно прописи, только вместо пыльцы мы видим на препарате удивительные картинки фаз мейоза, а их в мейозе 12, в отличие от 4 фаз митоза (рис. 22).
Рис. 22. Гаплоидный набор хромосом (n=8) Cimicifuga foetida.
Стадия диакинеза, хромосомы представлены бивалентами. Фото С.А. Красниковой.
АНАТОМИЯ И ГИСТОЛОГИЯ
Получение постоянных препаратов для анатомических и гистологических исследований состоит из последовательных стадий: фиксация и промывка материала от фиксатора, обезвоживание, заливка в парафин и получение тонких срезов, окрашивание срезов, заключение срезов в среду, которая обеспечивает длительное хранение препаратов.
Фиксация и промывка материала от фиксатора. Цель фиксации – сохранить клеточные оболочки и сделать материал более удобным для резки. При этом объект консервируется и в зависимости от способов фиксации происходит уплотнение или размягчение объекта.
Существуют водные и спиртовые фиксаторы. Для фиксации мелких эмбриологических объектов используют водный фиксатор Навашина (1% хромовая кислота : 16% формалин : ледяная уксусная кислота / 10 : 4 : 1). Фиксатор готовится непосредственно перед использованием. Действует фиксатор очень мягко и хорошо сохраняет структуру с точки зрения морфологии. Для исследования материал отмывается от фиксатора водой (4 – 6 раз по 20 – 30 мин), а затем проводят через этиловый спирт повышающейся концентрации: 10°, 20°, 70°.
Желательно в спиртовых фиксаторах использовать 70° этиловый спирт, так как 96° спирт сильно уплотняет ткани и делает их хрупкими и может деформировать объект.
Последнее время широкое распространение получил фиксатор FAA (70° этиловый спирт : 40% формалин : ледяная уксусная кислота / 100 : 7 : 7 (в мл). В этом фиксаторе можно оставить материал в холодильнике на неделю и более в зависимости от размеров объекта. Для более длительного хранения материал отмывается 70° спиртом (до исчезновения запаха уксусной кислоты) и хранится в 70° спирте.
Заливка в парафин и получение тонких срезов. Материал, отмытый от фиксатора, обезвоживается этиловым спиртом повышающейся концентрации: 80°, 90°, 96°, а затем помещается в смесь 100° этилового спирта и хлороформа, с постепенным повышением концентрации хлороформа в смеси (3 : 1; 1 : 2; 1: 3) (по 1 часу в каждом) и затем в чистый хлороформ.
Далее в кювету насыпается стружка из парафина или парапласта, чтобы полностью был закрыт материал, и на ночь помещается в вытяжной шкаф, а затем в термостат при температуре 54–56°С до полного исчезновения запаха хлороформа. При необходимости подсыпают стружку. Материал, заключенный в парафин, хранится в парафиновых блоках. Очень мелкий материал вырезают из блока кубиками и приклеивают к деревянному блоку (разогретым шпателем) для резки на микротоме.
Для работы с более крупным материалом парафиновые блоки расплавляются, и материал помещают в разогретую каплю, предварительно сформированную на деревянном блоке. Объект опускают, ориентируя его в нужном направлении и в плоскости, и закапывают расплавленным парафином или парапластом сверху, чтобы объект утонул в нем.
Готовые парафиновые кубики режутся на ротационном микротоме НМ-325 толщиной 5-10 мкм (в зависимости от объекта). Полученные ленты приклеиваются с помощью белка на предметные стекла и высушиваются на нагревательном столике Slidewarmer SW 85, а затем помещаются в сушильный шкаф и высушиваются при температуре 37°С в течение 2–3 дней.
Освобождение от парафина (парапласта). Стекла с приклеенными лентами освобождают от парафина (парапласта) с помощью ксилола или толуола (трехкратная смена по 1 – 1.5 ч в каждом). Удаление ксилола или толуола происходит путем его замещения на 96° этиловый спирт (2 смены по 10-15 мин.), который далее удаляется промывкой срезов в дистиллированной воде в (2 раза по 15 мин.)
Приготовление красителей и окрашивание срезов. Для приготовления гематоксилина по Эрлиху необходимо 1 г гематоксилина растворить в 50 мл абсолютного спирта (можно и в 96°), к раствору добавить 5 мл ледяной уксусной кислоты, 50 мл дистиллированной воды и 1.5 г алюмокалиевых квасцов. На дне посуды должен оставаться избыток квасцов. Созревает краситель 1 месяц на свету в посуде, накрытой марлей, до приобретения вино-красного цвета. Признаками готовности маточного раствора являются запах вишневой патоки и полное отсутствие запаха уксусной кислоты. Для окраски используют маточный раствор, разбавленный в 2 раза дистиллированной водой.
Алциановый синий готовят непосредственно перед окраской препаратов. Для этого берут 100 мг красителя и растворяют в 100 мл 3% уксусной кислоты. Стекла с приклеенными лентами, освобожденные от парафина (парапласта) и промытые в дистиллированной воде, погружают на 15–20 мин в гематоксилин по Эрлиху, после чего следует промыть в дистиллированной воде – 20 мин (трех- четырехкратно меняя воду), а затем в 3% раствор уксусной кислоты на 1 – 2 мин и алциановый синий на 3–5 мин, и снова в 3% уксусную кислоту на 1 – 2 мин, с последующей 3 – 4х кратной промывкой в дистиллированной воде по 20 мин в каждой.
Приготовление среды заключения для длительного хранения срезов. К 12 мл 0,2 М Триc-HCl, pH 8,5 и 60 г глицерина добавляют 24 г Мовиола, тщательно перемешивают и дистиллированной водой доводят до получения объема 120 мл. Раствор помещают в термостат при температуре 53°С, систематически помешивая до полного растворения Мовиола. Готовый раствор хранят в морозильной камере при температуре – 20°С. Размораживают его за сутки до использования.
Монтирование препаратов. Полученные окрашенные стекла закапывают Мовиолом (4 – 5 капель) и закрывают покровным стеклом, стараясь удалить воздушные пузырьки. Готовые препараты высушивают в течение 2 – 3 суток в сушильном шкафу при температуре 37°С и рассматривают под микроскопом (рис. 23). Приготовленные таким способом препараты хранятся несколько лет.
Рис. 23. Фотографии некоторых анатомических препаратов.
Окраска гематоксилином по Эрлиху и алциановым синим: а – продольный разрез цветка Allium altissimum; б – поперечный разрез цветка Allium altissimum; в – продольный разрез генеративной почки Cerasus fruticosa; г – поперечный срез генеративной почки гибрида Cerasus pensylvanica x C. fruticosa; д – продольный разрез почки Disanthus cercidifolius; е – продольный разрез семянки межродового гибрида Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis. Фото Т.В. Полубояровой.
АНАТОМИЯ ЛИСТА (поперечные срезы хвои)
Получение срезов листьев хвойных пород, как оказалось, имеет свои особенности и ниже приводится довольно простая и действенная пропись.
Свежесобранная или с гербарных образцов хвоя вымачивается в дистиллированной или кипяченой воде 2–3 суток или более при комнатной температуре. После этого материал можно хранить в холодильнике долгое время, периодически заменяя воду.
Такое длительное вымачивание позволяет получить качественные срезы даже на довольно старом гербарном материале (несколько десятков лет). Простое кипячение, особенно на старом материале, не дает такого эффекта.
Для дальнейшей работы вырезаются фрагменты в нижней, средней и верхней части хвоинки. Анализируется не менее 30 хвоинок.
Термоохлаждающий столик ТОС-II, установленный на микротоме МС-2(=замораживающий микротом), включают и охлаждают 5-10 минут. После охлаждения, до образования изморози, в центр квадрата столика помещают каплю воды и немедленно вертикально опускают в неё отрезок хвоинки длиной 1 см. При определенном опыте можно непосредственно ставить влажную хвоинку на столик. Здесь важно проследить за вертикальным положением хвоинки, особенно в начале заливки. В противном случае на срезах будут искажены форма и размеры внутренних структур.
Выждав некоторое время, сверху по каплям добавляют воду, формируя таким способом ледяной конус, в центре которого находится хвоя. Чем больше будет основание конуса, тем крепче будет держаться объект. Высота конуса должна быть не более 5–7 мм. Излишек хвоинки отрезают. Выждав 10-15 минут, начинают делать срезы толщиной 10–25 мкм. Срезы собирают с ножа мягкой кисточкой на предметное стекло.
Временные препараты готовят в воде или, для более длительного хранения и просветления срезов, в глицерине. Дополнительной окраски срезов не требуется (рис. 24).
На препаратах или фотографиях определяют следующие морфо-анатомические параметры: ширину хвои, толщину кутикулы, количество смоляных каналов, диаметр смоляных каналов и проводящих пучков, толщину клеток эндодермы, ширину клеток мезофилла и др. При серийных срезах можно обнаружить срезы через устьичный аппарат.
Рис. 24. Поперечный срез хвои Pinus pumila:
а – целая хвоя, б – фрагмент. Фото С.В. Шишкина.
АНАТОМИЯ КОРНЕЙ, КОРНЕВИЩ, СТЕБЛЕЙ, ЛИСТЬЕВ
И ДРУГИХ ОРГАНОВ
Аналогичным образом готовятся препараты листьев, стеблей, корней и корневищ различных растений (рис. 25, 26). Отличается только этап предварительной обработки.
Для фиксации материала используют 70% этиловый спирт, в котором можно длительное время хранить материал. Широко используется в анатомии фиксатор ФУС (смесь формалина, уксусной кислоты и этилового спирта). Для приготовления 100 мл фиксатора к 90 мл 50% спирта добавляется 5 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл формалина (40% формальдегида). Материал фиксируют несколько часов, затем промывают в нескольких сменах 50% спирта и хранят в 96% спирте. Для лучшего проникновения фиксатора в ткани стебля, листа и других органов последние разрезают на небольшие куски, размером 0.5–1.0 см (для микротомных препаратов) или 2.0–4.0 см для резки срезов от руки.
При использовании замораживающего микротома материал отмывается от фиксатора в проточной воде 20–30 минут.
Сухой материал сначала размачивают в дистиллированной воде, затем кипятят для придания гибкости. Если такая обработка недостаточна, то действуют на размягченный материал слабым раствором аммиака или едкого калия (натрия). Продолжительность действия реактивов в каждом конкретном случае различна. Гербарный материал предварительно размачивается в смеси из спирта, глицерина и воды, взятых в равных соотношениях.
Для приготовления срезов из сухой древесины небольшие кусочки нужно кипятить в воде 30–60 минут или больше для удаления из тканей воздуха. Затем следует поместить ее в смесь из 96% этилового спирта и глицерина (в равной пропорции). Время подбирается экспериментально. Перед тем как делать срезы, материал необходимо тщательно промыть в проточной воде.
Промывке материала водой необходимо уделять особое внимание, особенно если предстоит делать срезы на замораживающем микротоме, так как остатки глицерина или спирта не позволяют качественно заморозить материал и в результате середина среза окажется смятой.
Замораживать материал можно в 4% растворе желатина. Последний хорошо сохраняет форму объекта. Полученные срезы собираются мягкой кисточкой в чашку Петри с подогретой водой для растворения желатина.
Рис. 25. Анатомические и гистологические препараты: а – поперечный срез средней жилки листа Prunus sp.; б – поперечный срез листа Fragaria sp. Фото Т.В. Полубояровой.
Рис. 26. Локализация кадмия в корне Eichhornia crassipes после выращивания на среде с добавлением солей Cd (окраска дитизоном):
а – общий вид; б – фрагмент. Фото Т.Е. Романовой.
Для приготовления срезов от руки используется опасная бритва и сердцевина бузины (классический вариант!). И первое и второе в настоящее время, к сожалению, малодоступно.
Опасную бритву можно заменить лезвием для бритья, предварительно сделав из полоски металла оправку. Можно использовать оправку от сменных лезвий для скребков Stayer (рис. 27). Эти лезвия можно использовать для получения срезов после дополнительной точки на камне и правки.
Рис. 27. Набор для приготовления срезов бритвой от руки. Фото А.А. Красникова.
Сердцевину бузины можно заменить пенопластом или пенополистиролом (сердцевина утеплителя для стен, обычно светло-оранжевого цвета). Для удобной работы вырезается цилиндр или усеченный конус длиной 4–5 см. Сверху в прорезь вставляется листовая пластинка (иногда несколько), стебель и т.п. При изготовлении срезов такой цилиндр берется в левую руку, большим и указательным пальцами сжимается верх (фиксируется объект), а правой рукой с зажатым лезвием делают срез. Лезвие нужно двигать на себя наискось одним плавным быстрым движением. Для уменьшения прилипания среза к лезвию, объект режут во влажном состоянии. Для этого бритву и материал смачивают водой, если срезы делают с живого материала, или спиртом, если он хранился в спирте. Полученные срезы снимают с лезвия при помощи препаровальной иглы или мягкой кисточки в чашку Петри с дистиллированной водой.
Временные препараты можно приготовить в капле воды или, для более длительного хранения, в глицерине.
Здесь мы намеренно не останавливаемся на способах и методах окраски анатомических препаратов, цели и задачи которых разнообразны. На Рис. 24 и 25 приведены препараты с естественной окраской. С методами окраски рекомендуем ознакомиться в приводимом ниже списке литературы.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ СЭМ
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НА HITACHITM-1000
Пробоподготовка является ключевым этапом в исследовании любого объекта. Некачественная или недостаточная пробоподготовка может служить причиной ошибок и сбоев в работе оборудования. Это может не только повлиять на результаты работы и качество анализа, но и вывести оборудование из строя.
Режим низкого вакуума HITACHI TM-1000 позволяет исследовать непроводящие (живые) образцы без предварительного напыления проводящего слоя.
Материал для исследования (не более 10х10 мм) монтируется на стандартные алюминиевые или латунные столики диаметром 20 мм. Для этого существует несколько способов:
а) образец приклеивается серебряным или углеродным проводящим клеем на столик;
б) образец закрепляется на столике при помощи двухсторонней проводящей углеродной или металлической ленты-скотча или на специальных круглых проводящих углеродных держателях (таблетках).
Примечание. Важно! Образец не должен быть слишком влажным или слишком сухим. Свежесобранные б.м. мясистые листья, цветки или части стебля следует подсушить несколько часов (иногда несколько дней) между слоями фильтровальной бумаги. Во втором случае, наоборот, образец следует подержать во влажной камере от нескольких минут до нескольких часов. Время, как в первом, так и во втором случае подбирается экспериментально.
Листья, семена, плоды многих растений покрыты толстым слоем кутикулы, маскирующей рисунок поверхности. Для удаления кутикулы материал обрабатывают в органических растворителях: бензоле, ксилоле, хлороформе, нефрасе (бензин для зажигалок). Используют как чистые растворы, так и в различной комбинации, например хлороформ и метанол в соотношении 1 : 1. Для каждого объекта пропорции и время обработки подбирается экспериментально, но не менее суток (иногда 2–3) при использовании органических растворителей. Хорошие результаты дает обработка материала в смеси кислот, например уксусная кислота / серная кислота, 9 : 1. С большой осторожностью можно обработать объект в чистой серной кислоте, в течение нескольких секунд, после чего материал необходимо хорошо промыть в дистиллированной воде и высушить.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НА EVOMA 10
Материал для исследования монтируется на стандартные алюминиевые или латунные столики диаметром 10 мм. Одновременно в камеру микроскопа помещается 9 или 16 столиков. Образец приклеивается серебряным или углеродным проводящим клеем на столик или закрепляется на столике при помощи двухсторонней проводящей углеродной или металлической ленты-скотча или на специальных круглых проводящих углеродных держателях (таблетках).
Проводящие (металлические) образцы обычно не требуют специальной подготовки и могут быть непосредственно помещены в камеру микроскопа. Если требуется, образцы могут подвергаться очистке, например, ультразвуком.
Непроводящие образцы обычно подвергаются напылению тонкого проводящего слоя для снятия заряда и экранирования падающего пучка от накопленного в объёме материала заряда. Для проводящих покрытий чаще всего используют углерод, алюминий, медь, золото или сплав золота с палладием. Напыление золота или сплава на его основе позволяет получать микрофотографии с бо́льшим увеличением и контрастом. Напыление производится на установке Mini SC 7620.
Если невозможно напыление пленки на образец, то в СЭМ с переменным вакуумом возможно снятие заряда с образца ионами вводимых в камеру газов (обычно водяные пары или азот). Накопления заряда на образце так же можно избежать при работе при низких ускоряющих напряжениях.